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ELISA試劑盒屬固相免疫測定，抗原、抗體的只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標本，其間的抗原并不是都有平等的和固相抗的機會，只需zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐，因此需經分散才干到達反響的結尾。在這以后參加的酶符號抗體與固相抗原的也相同如此。這就是為何ELISA試劑盒反響老是需求必定時刻的溫育。
有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，再在其間參加血清標本，然后在微型震動器上震動1分鐘以確保混和。加酶物使用液和底物使用液時可用定量多道加液器，使加液進程敏捷完結。在ELISA檢查試劑盒中通常有兩次抗原抗體反響，即加標本和加酶物后。抗原抗體反響的完結需求有必定的溫度和時刻，這一保溫進程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA檢查試劑盒中似不恰當。
ELISA試劑盒溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體的合適溫度。在樹立ELISA方法作反響動力學研討時，實驗標明，兩次抗原抗體反響通常在37℃經1-2小時，產品的生成可達高峰。為加快
反響，可進步反響的溫度，有些實驗在43℃進行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為*，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中，以形成zui多的沉積。但因所需時刻太長，在Elisa試劑盒中通常不予選用。
保溫的方式除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，通常均選用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA試劑盒板底應貼著水面，使溫度敏捷平衡。為避免蒸騰，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反響板漂浮在水面上。
若用保溫箱，ELISA試劑盒板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性杰出的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui終將ELISA試劑盒板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規則的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴仍是濕盒溫育，反響板均不宜疊放，以確保各板的溫度都能敏捷平衡。室溫溫育的反響，操作時的室溫應嚴厲約束在規則的范圍內，規范室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的請求操控溫育。室溫溫育時，ELISA試劑盒板只需平置于操作臺上即可。應留意溫育的溫度和時刻應按規則力求準確。為確保這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板一起測定。