在臨床實驗室，對試劑準備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題，ELISA試劑盒其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此在的是在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，
①磷酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0)：稱Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O 6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL。
② TMB 貯液：稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中，4℃避光保存。
③底物應用液：現用現配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB 貯液10μL。30%H2O2 15μL，混勻。
7. 終止液：2mol/LH2SO4
四、操作步驟
①抗原包被：兔抗人IgG 作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板
中。4℃放置過夜。
②洗滌：次日傾去凹孔內的液體，洗滌液洗3次。
③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h。
④洗滌：用洗滌液洗3次。
⑤加待測樣品(一抗)：將含單克降抗體的細胞培養上清在另—塊板上用PBS 連續稀釋(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，PBS 或空白培養基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h。
⑥洗滌：用洗滌液洗3次。
⑦加酶標抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l ：8000稀釋，100μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。
⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。
⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍色。
⑩終止反應、比色：加50μL/孔終止液.顏色變黃;用酶標儀測定450nm 處各孔的吸光值，陽性反應的zui大稀釋度為待測樣品的效價。
目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨時配制。
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