因為ELISA試劑盒測定中單個空缺孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空缺孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，所以在ELISA測定比色時，是使用雙波長比色。ELISA試劑盒因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的長處。ELISA試劑盒比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按劃定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。
zui后酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。以軟板為載體的試驗，需先將板置于尺度96孔的座架中，才可進行比色。ELISA試劑盒比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔。
所謂的單波長比色等于通常的以對顯色具有zui大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，ELISA試劑盒使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。
以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，ELISA試劑盒而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據要求隨時更換。
