以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。ELISA試劑盒37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度．
在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2小時，產(chǎn)物的天生可達。ELISA試劑盒濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預溫至劃定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如斯。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育，有人稱之為孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當。這就是為什么ELISA反應(yīng)老是需要一定時間的溫育。為加速反應(yīng)，可進步反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫順4℃等。室溫溫育時要平置于操縱臺上即可。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標本和加酶結(jié)合物后。不管是水浴仍是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜籠蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。ELISA試劑盒若用保溫箱，應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA板放在濕紗布上。應(yīng)留意溫育的溫度和時間應(yīng)按劃定力求正確。抗原抗體反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成zui多的沉淀。室溫溫育的反應(yīng)，操縱時的室溫應(yīng)嚴格限制在劃定的范圍內(nèi)，尺度室溫溫度是指20～25℃，但詳細操縱時可根據(jù)仿單的要求控制溫育。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如斯。為保證這一點，一個人操縱時，一次不宜多于兩塊板同時測定.。但因所需時間太長，一般不予采用。
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